Содержание статьи
Как проводится оценка метода диагностики?
ПЦР диагностика на сегодняшний день является «золотым стандартом» в области медицины. С помощью этого метода можно обнаружить различные инфекции. Наиболее часто определяемыми являются:
- половые инфекции;
- туберкулёз;
- цитомегаловирус;
- ВИЧ;
- гепатиты;
- герпес и многие другие.
Кроме ПЦР-диагностики инфекций, этот метод используется в криминалистике для установления родственных связей, в генетике.
ПЦР универсальна, позволяет обнаружить любую последовательность, имеет 100% специфичность, так как определяется последовательность уникальная для определённого вида микроорганизма. Благодаря различным усовершенствованиям можно определить количество нуклеиновый кислоты, например, таким образом оценивается вирусная нагрузка у лиц с гепатитами, что помогает выбрать тактику лечения.
Для анализа достаточно небольшого количества исходного материала, что является огромным плюсом в работе криминалистов и судмедэкспертов.
ПЦР не требует длительного времени как бакпосев, её стоимость сравнима с другими лабораторными тестами.
Однако для получения достоверных результатов необходим высокий уровень профессионализма и точное соблюдение техники выполнения.
Нуклеиновая кислота
В зависимости от типа возбудителя в его организме может присутствовать ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота). Мономерами в строении нуклеиновой кислоты являются азотистые основания: пуриновые – аденин (А), гуанин (Г); пиримидиновые – цитозин (Ц), урацил (У), тимидин (Т). К ним присоединяется углевод – рибоза или дезоксирибоза и остаток фосфорной кислоты. В таком составе они образуют цепь нуклеиновой кислоты.
Важной особенностью является строение ДНК. Она имеет спирально-закрученное двухцепочечное строение: на одной цепи выстраиваются азотистые основания, на второй они выстраиваются по принципу комплементарности к первой.
Комплементарными основаниями являются:
- аденин – тимин;
- цитозин – гуанин.
Они соединяются между собой водородными связями, обеспечивающими прочность молекулы.
Репликация
Метод полимеразной цепной реакции основан на многократном увеличении копий определённого участка цепи нуклеиновой кислоты. В основе этого лежит такой процесс, как репликация – синтез нуклеотидов по матричной цепи согласно принципу комплементарности.
Историческая справка
В 1983-м Кэри Мюллис создал метод, который в искусственных условиях с помощью фермента позволил выделить участок ДНК в ходе циклов удвоений. За открытие ПЦР в 1993-м году он получил Нобелевскую премию.
Состав реакционной смеси
- Taq-ДНК-полимераза. Обеспечивает синтез новой цепи ДНК со скоростью до тысячи пар оснований в минуту. Является термостабильной, активна при 72°С.
- Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP). Выстраиваются в новую цепь согласно принципу комплементарности. Их не должно быть в избытке, так как это может привести к неправильному присоединению при ПЦР.
- Праймеры. Они представляют собой короткие участки нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), которые помогают в дальнейшем проводить синтез дочерней цепи ДНК. Учитывая, что они встраиваются в фрагменты ДНК, их должно быть в избытке.
- Буферная система. Её состав обеспечивает оптимальную работу и высокий выход продукта реакции. Раствор солей поддерживает необходимый уровень рН. Ионы магния, связываясь с дезоксинукелотидами, являются субстратами для полимеразы. Бычий сывороточный альбумин предотвращает прилипание смеси к стенкам пробирок.
- ДНК-матрица. Исходной ДНК не должно быть в большом количестве, чтобы не снизилась чувствительность и эффективность ПЦР.
Метод ПЦР
Метод ПЦР проводится в 20 – 45 циклов, каждый из которого включает стадии:
- денатурация;
- отжиг праймеров;
- элонгация.
Все три стадии протекают с разной температурой (таблица 1), поэтому необходим специальный прибор, который чётко регулирует температурный режим – амплификатор.
Таблица 1. Температурный режим стадий ПЦР.
| Стадия | Температура |
| Денатурация | 94 – 96°С |
| Отжиг праймеров | 40 – 60°С |
| Элонгация | 72°С |
Денатурация
Чтобы считать последовательность азотистых оснований на молекуле ДНК, необходимо её раскрутить, то есть под денатурацией понимают расхождение цепей молекулы в результате определённого воздействия (высокая температура, рН).
При нагревании до 94 – 96°С до 1,5 минут цепи ДНК расходятся.
Отжиг праймеров
На этой стадии происходит комплементарное связывание праймеров с матричной цепью ДНК, которые, таким образом, ограничивают необходимый для репликации участок. Температура этой стадии составляет 40 – 60°С и длится не больше 1 минуты.
Элонгация
Суть стадии элонгации заключается в синтезе новой дочерней цепи ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, которая обеспечивает образование новой структуры по ограниченному праймерами участку.
Температура проведения элонгации зависит от ДНК-полимеразы. Например, Taq-полимераза стабильна при 72°С. Длительность стадии зависит от размера копируемого участка, обычно приходится около 1-й минуты на 1000 пар оснований.
Количество продукта, образуемого в результате ПЦР, в теории растёт в геометрической прогрессии: 1 молекула ДНК даёт начало двум другим, а те в последующем точно также. Это можно вычислить по формуле:
А = 2 n , где А – количество продукта, n – количество циклов реакции.
Больше 45 циклов проводить не рекомендуется, так как образуются побочные продукты реакции.
Детекция
Для анализа полученной амплифицированной ДНК используются разные методы детекции: гель-электрофорез (агарозный, полиакриламидный), гибридизация по Саузерну. Более точные результаты известны при секвенировании – определении последовательности нуклеотидов в цепи.
Может использоваться нуклеотидный зонд, который метится флуоресцеином, проявляется в реакции электрохемилюминесценции или при помощи моноклональных антител.
ПЦР в реальном времени
В современных лабораториях используется улучшенная версия – ПЦР в режиме реального времени. В реакционную смесь добавляется флуоресцентный зонд или интеркалирующий краситель, что позволяет оценивать явление флуоресценции каждый цикл. Это обеспечивает количественную характеристику образуемого продукта в пробирке, отражаемую на графике.
Можно вносить несколько зондов, что позволяет проводить детекцию нескольких продуктов реакции.
Контаминация
Под контаминацией понимают загрязнение реакционной смеси веществами из окружающей среды, что может привести к ложноположительному результату. Чтобы этого не происходило, есть ряд правил:
- использование чистых перчаток;
- одноразовые пробирки;
- одноразовые наконечники;
- проведение обработки поверхности столов и приборов;
- УФ-обработка помещения;
- разделение ПЦР-лаборатории на зоны.
Для точности метода всегда вместе с опытными пробами ставится положительный и отрицательный контроль. Также проводятся исследования смывов с поверхностей для оценки чистоты поверхностей.
Заключение
Полимеразная цепная реакция имеет важное значение в диагностике заболеваний (инфекционных, наследственных, опухолевых, неинфекционных), в фармакогенетике (влияние генов на метаболизм лекарственного средства), установлении личности, родственных связей, в генной инженерии, археологии, сельском хозяйстве и других областях. Благодаря этому методу мы смогли шагнуть вперёд, он невероятен по своим возможностям и ещё нет конца раскрытому потенциалу.
Мы приложили много усилий, чтобы Вы смогли прочитать эту статью, и будем рады Вашему отзыву в виде оценки. Автору будет приятно видеть, что Вам был интересен этот материал. Спасибо!
(6 оценок, среднее: 5,00 из 5)
Загрузка...