УСТАМИ ВРАЧЕЙ — это медицинский интернет-проект, исключительной особенностью которого является то, что обо всех известных заболеваниях и состояниях организма человека рассказывают профессионалы своего дела.

Полимеразная цепная реакция – «золотой стандарт» в области диагностики инфекций

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - является современным методом диагностики, позволяющим проводить идентификацию возбудителя инфекционного заболевания, например, по его нуклеиновой кислоте.

ПЦР

Как проводится оценка метода диагностики?

ПЦР диагностика на сегодняшний день является «золотым стандартом» в области медицины. С помощью этого метода можно обнаружить различные инфекции, наиболее часто определяемыми являются:

  • половые инфекции;
  • туберкулёз;
  • цитомегаловирус;
  • ВИЧ;
  • гепатиты;
  • герпес;
  • и многие другие.

Кроме ПЦР диагностики инфекций, этот метод используется в криминалистике для установления родственных связей, в генетике.

Полимеразная цепная реакция

ПЦР универсальна, позволяет обнаружить любую последовательность, имеет 100% специфичность, так как определяется последовательность уникальная для определённого вида микроорганизма. Благодаря различным усовершенствованиям можно определить количество нуклеиновый кислоты, например, таким образом оценивается вирусная нагрузка у лиц с гепатитами, что помогает выбрать тактику лечения.

Для анализа достаточно небольшого количества исходного материала, что является огромным плюсом в работе криминалистов и судмедэкспертов.

ПЦР не требует длительного времени, как бакпосев, её стоимость сравнима с другими лабораторными тестами.

Однако для получения достоверных результатов необходим высокий уровень профессионализма и точное соблюдение техники выполнения.

Нуклеиновая кислота

В зависимости от типа возбудителя в его организме может присутствовать ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота). Мономерами в строении нуклеиновой кислоты являются азотистые основания: пуриновые – аденин (А), гуанин (Г), пиримидиновые – цитозин (Ц), урацил (У), тимидин (Т). К ним присоединяется углевод – рибоза или дезоксирибоза и остаток фосфорной кислоты. В таком составе они образуют цепь нуклеиновой кислоты.

Важной особенностью является строение ДНК. Она имеет спирально-закрученное двухцепочечное строение: на одной цепи выстраиваются азотистые основания, на второй они выстраиваются по принципу комплементарности к первой.

Комплементарными основаниями являются:

  • аденин – тимин;
  • цитозин – гуанин.

Они соединяются между собой водородными связями, обеспечивающие прочность молекулы.

Нуклеиновая кислота

Репликация

Метод полимеразной цепной реакции основан на многократном увеличении количества определённого участка цепи нуклеиновый кислоты. В основе этого лежит такой процесс, как репликация – синтез нуклеотидов по матричной цепи согласно принципу комплементарности.

Историческая справка

В 1983-м Кэри Мюллис создал метод, который в искусственных условиях с помощью фермента позволил выделить участок ДНК в ходе циклов удвоений. За открытие ПЦР в 1993-м году он получил Нобелевскую премию.

Состав реакционной смеси

  1. Taq-ДНК-полимераза. Обеспечивает синтез новой цепи ДНК со скоростью до тысячи пар оснований в минуту. Является термостабильной, активна при 72°С.
  2. Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP). Выстраиваются в новую цепь согласно принципу комплементарности. Их не должно быть в избытке, так как это может привести к неправильному присоединению при ПЦР.
  3. Праймеры. Они представляют собой короткие участки нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), которые помогают в дальнейшем проводить синтез дочерней цепи ДНК. Учитывая, что они встраиваются в фрагменты ДНК, их должно быть в избытке.
  4. Буферная система. Её состав обеспечивает оптимальную работу и высокий выход продукта реакции. Раствор солей поддерживает необходимый уровень рН. Ионы магния, связываясь с дезоксинукелотидами, являются субстратами для полимеразы. Бычий сывороточный альбумин предотвращает прилипание смеси к стенкам пробирок.
  5. ДНК-матрица. Исходной ДНК не должно быть в большом количестве, чтобы не снизилась чувствительность и эффективность ПЦР.

Если в качестве матрицы используется молекула РНК, то необходимо вносить дополнительно специальный фермент – РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратная транскриптаза, ревертаза), которая синтезирует комплементарную ей цепь ДНК, считающуюся в дальнейшем матрицей в ПЦР.

Метод ПЦР

Метод ПЦР проводится в 20 – 45 циклов, каждый из которого включает стадии:

  • денатурация;
  • отжиг праймеров;
  • элонгация.

Все три стадии протекают с разной температурой (таблица 1), поэтому необходим специальный прибор, который чётко регулирует температурный режим – амплификатор.

Таблица 1. Температурный режим стадий ПЦР.

СтадияТемпература
Денатурация94 – 96°С
Отжиг  праймеров40 – 60°С
Элонгация72°С

Денатурация

Чтобы считать последовательность азотистых оснований на молекуле ДНК, необходимо её раскрутить, то есть под денатурацией понимают расхождение цепей молекулы в результате определённого воздействия (высокая температура, рН).

При нагревании до 94 – 96°С до 1,5 минут цепи ДНК расходятся.

Денатурация

Отжиг праймеров

На этой стадии происходит комплементарное связывание праймеров с матричной цепью ДНК, которые, таким образом, ограничивают необходимый для репликации участок. Температура этой стадии составляет 40 – 60°С и длится не больше 1 минуты.

Элонгация

Суть стадии элонгации заключается в синтезе новой дочерней цепи ДНК с помощью фермента – ДНК-полимеразы, которая обеспечивает образование новой структуры по ограниченному праймерами участку.

Температура проведения элонгации зависит от ДНК-полимеразы. Например, Taq-полимераза стабильна при 72°С. Длительность стадии зависит от размера копируемого участка, обычно приходится около 1-й минуты на 1000 пар оснований.

Количество продукта, образуемого в результате ПЦР, в теории растёт в геометрической прогрессии: 1 молекула ДНК даёт начало двум другим, а те в последующем точно также. Это можно вычислить по формуле:

А = 2 n , где А – количество продукта, n – количество циклов реакции.

Больше 45 циклов проводить не рекомендуется, так как образуются побочные продукты реакции.

Метод ПЦР

Детекция

Для анализа полученной амплифицированной ДНК используются разные методы детекции: гель-электрофорез (агарозный, полиакриламидный), гибридизация по Саузерну. Более точные результаты известны при секвенировании – определении последовательности нуклеотидов в цепи.

Может использоваться нуклеотидный зонд, который метится флуоресцеином, проявляется в реакции электрохемилюминесценции или при помощи моноклональных антител.

ПЦР в реальном времени

В современных лабораториях используется улучшенная версия – ПЦР в режиме реального времени. В реакционную смесь добавляется флуоресцентный зонд или интеркалирующий краситель, что позволяет оценивать явление флуоресценции каждый цикл. Это обеспечивает количественную характеристику образуемого продукта в пробирке, отражаемую на графике.

Можно вносить несколько зондов, что позволяет проводить детекцию нескольких продуктов реакции.

ПЦР в реальном времени

Контаминация

Под контаминацией понимают загрязнение реакционной смеси веществами из окружающей среды, что может привести к ложноположительному результату. Чтобы этого не происходило, есть ряд правил:

  • использование чистых перчаток;
  • одноразовые пробирки;
  • одноразовые наконечники;
  • проведение обработки поверхности столов и приборов;
  • УФ-обработка помещения;
  • разделение ПЦР-лаборатории на зоны.

Для точности метода всегда вместе с опытными пробами ставится положительный и отрицательный контроль. Также проводятся исследования смывов с поверхностей для оценки чистоты поверхностей.

Контаминация

Заключение

Полимеразная цепная реакция имеет важное значение в диагностике заболеваний (инфекционных, наследственных, опухолевых, неинфекционных), в фармакогенетике (влияние генов на метаболизм лекарственного средства), установлении личности, родственных связей, в генной инженерии, археологии, сельском хозяйстве и других областях. Благодаря этому методу мы смогли шагнуть вперёд, он невероятен по своим возможностям и ещё нет конца раскрытому потенциалу.

Наталья Даниленко
Наталья Даниленко, Врач клинической лабораторной диагностики 42 статей на сайте
Выпускница факультета медико-профилактического дела и медицинской биохимии, отделения медицинской биохимии СГМУ (бывш. АГМА). Специальность по диплому - врач-биохимик (врач клинической лабораторной диагностики).
Оценка статьи

Мы приложили много усилий, чтобы Вы смогли прочитать эту статью, и будем рады Вашему отзыву в виде оценки. Автору будет приятно видеть, что Вам был интересен этот материал. Спасибо!

1 Звезда2 Звезды3 Звезды4 Звезды5 Звезд (2 оценок, среднее: 5,00 из 5)
Загрузка...
К этой статье пока нет комментариев. Сделайте это первым!

Напишите Ваш комментарий